พระอุโบสถของวัดราชาธิวาสวิหาร สร้างขึ้นในสมัยพระบาทสมเด็จพระนั่งเกล้าเจ้าอยู่หัว รัชกาลที่ ๓ และบูรณะปฏิสังขรณ์เรื่อยมา กระทั่งพระบาทสมเด็จพระจุลจอมเกล้าเจ้าอยู่หัว รัชกาลที่ ๕ ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้สมเด็จพระเจ้าบรมวงศ์เธอ เจ้าฟ้ากรมพระยานริศรานุวัดติวงศ์ หรือ “สมเด็จครู” เป็นผู้บูรณะซ่อมแซมใหม่ทั้งหมด แต่ยังคงแบบเดิมไว้ โดยตั้งหันไปทางทิศตะวันตก ลงสู่แม่น้ำเจ้าพระยา อยู่ในตำแหน่งเดียวกับหลังเดิม
ภายในประดิษฐานพระพุทธรูปพระสัมพุทธพรรณี (จำลอง) เป็นพระพุทธรูปศิลปะรัตนโกสินทร์ ปางสมาธิราบ ขนาดหน้าตักกว้าง ๒๐ นิ้ว วัสดุโลหะกะไหล่ทองไม่มีพระเกตุมาลา พระจีวรเป็นริ้วเช่นเดียวกับครองผ้าของพระภิกษุ ซึ่งจำลองจากพระสัมพุทธพรรณี องค์ที่ประดิษฐานอยู่ในพระอุโบสถวัดพระศรีรัตนศาสดาราม โดยใต้ฐานพระพุทธรูปเป็นที่ประดิษฐานพระสรีรังคารสมเด็จพระศรีสวรินทิราบรมราชเทวี พระพันวัสสาอัยยิกาเจ้า
จุดเด่นคือจิตรกรรมสีปูนเปียก ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการปฏิบัติงานร่วมกันระหว่าง สมเด็จพระเจ้าบรมวงศ์เธอ เจ้าฟ้ากรมพระยานริศรานุวัดติวงศ์ ผู้ได้รับการยกยกว่า “สมเด็จครู” และ “นายช่างใหญ่แห่งกรุงสยาม” กับ คาร์โล ริโกลี จิตรกรมีชื่อชาวอิตาลี ซึ่งทางราชสำนักว่าจ้างให้เข้ามาเขียนภาพจิตรกรรมฝาผนัง ในเทคนิคปูนเปียกแบบตะวันตก ประดับภายในพระอุโบสถ
ภาพจิตรกรรมฝาผนัง แสดงเรื่องพระเวสสันดรชาดกทั้ง 13 กัณฑ์ ซึ่งสมเด็จพระเจ้าบรมวงศ์เธอ เจ้าฟ้ากรมพระยานริศรานุวัดติวงศ์ ทรงเป็นผู้ร่างภาพ และ คาร์โล ริโกลี จิตรกรชาวอิตาเลียน ด้วยเทคนิคการใช้สีปูนเปียก
พระสัมพุทธพรรณีเป็นพระประธาน มีเศวตฉัตร 9 ชั้น ซึ่ง ในหลวงรัชกาลที่ 5 ทรงหล่อพระราชทาน เบื้องบนพระประธานเป็นภาพพระพุทธเจ้าอยู่เหนือเมฆกำลังตอบปัญหาของพระสารีบุตรและพระอินทร์ ที่ใกล้พระประธานมีรูปศากยกษัตริย์พระประยูรญาติมาเฝ้าอยู่เบื้องหลัง
พระพุทธรูปด้านหลังพระอุโบสถคือ "พระสัมพุทธวัฒโนภาส" ซึ่งเป็นพระประธานองค์เดิมของวัด ประดิษฐานอยู่เบื้องหลังพระพุทธรูปองค์ปัจจุบันคือพระสัมพุทธพรรณี โดยที่พุทธบัลลังก์มีพระราชสรีรางคารของสมเด็จพระศรีสวรินทิรา บรมราชเทวี พระพันวัสสาอัยยิกาเจ้า บรรจุอยู่
จิตรกรรมสีปูนเปียก
พระสัมพุทธพรรณี
พระพุทธรูปด้านหลังพระอุโบสถ